1. 서 론

세포 수, 세포의 크기, 복잡도, 세포 주기 등을 측정할 수 있는 유세포 분석기 (flow cytometer)는 분석하고자 하는 세포의 표본이 현탁되어 있는 액체에 레이저 (Laser)를 조사하여 세포의 형태에 따른 빛의 산란 및 통과된 빛을 검출하여 분석하거나 형광 처리된 세포로부터 발현되는 빛의 파장에 따른 형광 산란을 측정하여 분석하는 기기이다⁽¹⁾. 유세포 분석기는 세포가 작은 관내에 흐르는 상태에서 광원인 레이저와 부딪히며 발생하는 빛의 산란과 형광물질의 발광, 두 가지의 물리적 현상을 이용하여 세포에 관한 여러 가지 정보를 측정 및 정밀분석이 가능하다⁽²⁾. 최근 들어, 형광물질의 개발과 다양한 파장의 레이저를 사용함으로써 오늘날의 유세포 분석기는 14가지 이상의 많은 매개변수를 동시에 측정하여 광학적 특성 분석이 가능하게 되었다⁽³⁾. 유세포 분석기는 그림 1과 같이 유체 시스템, 광학 시스템, 전자 시스템 등으로 구성되어있다⁽⁴⁾. 유체시스템은 세포의 광학적 특성을 정확하게 측정하기 위해서 분석될 세포가 하나씩 레이저 광선을 통과하도록 유도하며, 광학 시스템은 레이저 광선의 산란 및 형광물질의 발광에 대한 광학 정보를 광학 필터와 다이크로익 미러를 통해 각각의 파장에서 선택적으로 빛을 수집한다⁽⁵⁾. 분석하는 물질에서 발현하는 아날로그 신호인 광신호는 전자 시스템을 통해 컴퓨터로 처리할 수 있는 디지털 신호로 변환된다⁽⁶⁾. 상용화된 유세포 분석기에서 주로 광원으로 사용되는 레이저는 강한 강도의 일정한 파장을 갖는 단색광으로 잘 퍼지지 않고 집중도가 높다는 장점이 있다⁽²⁾. 레이저를 광원으로 사용할 경우, 세포가 일정 투과 점을 통과할 때 빛이 산란 되는데, 빛 진행 방향의 전면에서 감지한 빛을 전방산란 (forward scatter, FSC), 90°에서 감지한 빛을 측면산란 (side scatter, SSC)이라 하며, 형광물질의 발광을 감지한 빛을 형광산란 (fluorescent scatter, FL)이라 한다⁽⁷⁾.

유세포 분석기는 특히 면역계나 암이나 질병에 대한 면역 반응 등을 연구하는 데 효과적이며 백혈병 진단, 세포의 조직 형태와 부피 측정, DNA 및 RNA의 측정, 단백질의 발현 측정, 세포사멸 및 세포의 생존력 측정 등 많은 실험에 이용될 수 있어 분자 생물학, 면역학, 병리학 등 많은 분야에서 다양한 목적으로 이용되고 있다⁽¹⁾. 예를 들어, cisplatin을 난소암 세포 (SKOV3)에 처리하여 특정 단백질의 발현 및 세포사멸에 관한 연구, 테논낭 섬유아세포 (HTCFs)에 대해 황화수소 (HS)가 세포 분화 억제에 미치는 영향 및 세포사멸 유발에 관한 연구, 구강편평세포암종 (SCC)의 주기 분석을 통한 Heat shock proteins 90 (HSP90) 억제제로서의 Geldanamycin과 17-AAG가 세포증식 억제에 관한 연구와 두릅 추출물을 이용한 유방암세포 (MDA-MB-231)의 사멸 효과에 관한 연구 등의 최근 많은 연구에서 유세포 분석기가 활용된 바 있다^(8)-(11). 그러나 분석할 세포 각각에 대한 정밀분석이 아닌 표본 전체에 대한 빛의 산란 정도나 형광을 측정하여 세포의 광학적 특성을 단순 비교하거나 세포 수 측정과 같이 단순 분석만이 필요한 경우, 유세포 분석기는 고가이며 유지관리 측면에서 비합리적이다. 따라서 이에 대한 대안으로 세포의 광학 정보를 측정할 수 있는 저가이며 소형인 형광 탐지 시스템 설계에 관한 연구가 진행되었으며, 이미 선행연구에서 표본 전체에 대한 단일 형광 산란을 측정하여 세포 수와 높은 선형성을 보인 바 있다⁽¹²⁾, ⁽¹³⁾.

본 연구에서는 저가의 발광다이오드 (light-emitting diode; LED)와 광다이오드 (photodiode)를 활용하여 세포에 대한 광학 정보를 획득할 수 있는 시스템을 설계하고, 다파장 형광 모니터링 실험을 통해 형광 처리한 자궁경부암 세포 (human cervical cancer cells)의 측면산란을 측정하여 적절한 필터의 조합을 선정하고 형광 처리하지 않은 자궁경부암 세포의 측면산란을 측정하여 형광 처리 여부에 따른 측면산란의 차이로부터 특정 파장대의 형광 산란을 구하여 시스템의 성능을 평가하였다.

그림. 1. 유세포 분석기의 구성

Fig. 1. Composition of a flow cytometer

2. 실험 방법

2.1 회로 설계

본 연구에서 제안하는 모니터링 시스템에서 사용되는 광원은 유세포 분석기와 달리 레이저가 아닌 LED와 광다이오드를 사용하므로, 이에 대한 새로운 회로 시스템을 설계하였다. 실험에 사용되는 형광물질을 야기 시키기 위하여 470nm (Blue)와 620nm (Red)의 출력 파장을 갖는 LED (Photron, 3W, USA)가 사용되었고, 광원의 출력과 소비전력을 안정적으로 얻기 위해 그림 2(위)과 같이 MATLAB (MathWorks, USA)의 Simulink 기능을 통해 사용 가능한 Simscape를 활용하여, 정전압 회로와 정전류 회로를 구성하였다. 정전압 회로에서는 교환 방식 전원 공급 장치 (SMPS, 12V, 1A)로 부터 전원을 공급받아 정전압 집적회로 소자 (LM7809CT, On Semiconductor, USA)를 통해 9V의 안정된 전압을 정전류 회로에 공급한다. 출력의 안정성 및 기대 수명의 연장을 고려하여 670mA의 전류가 LED에 인가되도록 설계하였으며, 470nm LED의 경우 2.1W의 전력을 소비하고, 620nm LED의 경우 1.5W의 전력을 소비하도록 설계하였다. 또한, 각 소자의 발열로 인한 출력 감소 현상을 쿨링팬 (12V, 0.2A)을 활용하여 제어하였으며, 그 결과, 670mA$\pm$1mA의 안정적인 전류가 LED에 흐르는 것을 확인하였다.

그림. 2. (위) 정전압 및 정전류 회로, (아래) 광다이오드 동작 회로

Fig. 2. (up) Constant voltage & current circuit design, (down) Circuit design for photodiode driver

그림. 3. 광학 특성 모니터링 시스템

Fig. 3. Monitoring system of optical characteristics

광다이오드 (FDS1010, 350-1100nm, Thorlabs, USA)로부터 광신호를 획득하기 위해 그림 2(아래)와 같이 설계하였고, LED 회로와 마찬가지로 Simscape를 활용하여 설계 도면을 작성하였다. 9V의 전원을 SMPS로부터 공급받아 정전압 집적회로 소자를 통해 9V의 전압을 5V의 안정된 전압으로 변환하고, RC 회로를 통해 잡음을 제거하여 광다이오드에 역방향 바이어스를 인가하도록 하였다. 광다이오드는 역방향 바이어스가 인가되고 입사된 광이 없을 때는 일반적인 다이오드와 동일한 특성을 가지지만, 광이 입사할 때는 역방향 전류가 입사 광량과 비례하는 특성을 가진다. 따라서 광다이오드와 $10k\Omega$의 부하 저항($R_{L}$)을 직렬로 연결하고 부하 저항의 양단에 인가되는 전압을 그림 3과 같이 디지털 멀티미터를 활용하여 광신호를 측정할 수 있도록 설계하였다.

2.2 광학 모니터링 모듈제작

광학 모니터링 시스템은 그림 3과 4와 같이 광원인 LED를 제어하는 정전류 모듈과 LED, 광학 필터, 유리 큐벳, 광다이오드를 고정하기 위한 메인 모듈이 있고 측면산란을 측정하는 광다이오드와 디지털 멀티미터로부터 광신호를 획득하기 위한 광다이오드 모듈로 구성되어있다. LED에서 출력되는 빛은 1차 필터 (Excitation filter)를 통해 유리 큐벳에 담긴 자궁경부암 세포를 조사하며, 이로 인해 90°로 산란 된 빛은 2차 필터 (Emission filter)를 통해 광다이오드에 입사하는데, 이를 모니터링하기 위한 시스템이다.

그림. 4. 광학 모니터링 시스템의 모식도

Fig. 4. Schematic diagram of optical monitoring system

메인 모듈의 구조물은 3D 설계 소프트웨어인 SolidWorks (Dassault Systems, USA)를 사용하여 설계하였으며, 3D 프린터 (3DP-310F, Cubicon Inc., Korea)를 사용하여 출력하였다. 그림 5와 같이 광학 필터를 부착하기 위한 Filter holder, 유리 큐벳과 Filter holder를 고정하기 위한 Cuvette & Filter Slot, LED & Photodiode holder를 고정하기 위한 LED & Photodiode slot으로 구성된 간단한 구조이다. LED를 부착하여 고정하기 위한 LED holder는 내열성이 좋은 ABS 필라멘트를 사용하여 출력하였고, 나머지 부품들은 친환경 수지인 PLA+ 필라멘트를 사용하여 출력하였다⁽¹⁴⁾.

그림. 5. 메인 모듈의 3D 디자인

Fig. 5. 3D Design of the Main module

2.3 in vitro 실험

실험에 사용한 자궁경부암 세포 (한국 세포주 은행, 대한민국)는 37°C의 온도에서 5%의 이산화탄소를 포함한 환경의 배양기에서 고농도의 글루코스가 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), 10%의 Fetal Bovine Serum (FBS, pH 7.4)과 1%의 Penicillin Streptomycin으로 구성된 배지 용액으로 3-4일 증식시켰다. Phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4)을 사용하여 세척 작업을 하고, trypsin EDTA를 사용하여 세포 배양 플라스크로부터 자궁경부암 세포를 분리시켰다⁽¹⁵⁾. 그림 6과 같이 분리된 세포들을 두 그룹으로 나누어 형광 염료 DiD와 Calcein AM으로 형광 처리를 한 세포 $10\times 10^{6}$개를 PBS와 함께 각 유리 큐벳에 2$ml$의 세포 현탁액을 담고, 해당 용액의 세포 농도를 조절해 가며 각각 다른 10개의 세포 수 ($1,\:2,\:3,\:...10\times 10^{6}$개, 세포 수별 n=4)에 대해 다양한 광학 필터를 사용하여 측면산란을 측정하였다. 광학 필터는 필터 책자 (Roscolux series swatchbook, Rosco, USA)에서 1차 필터와 2차 필터에 대해 각각 2개씩 선정하고, 각 세포 수당 4회씩 측정하여 40개의 데이터를 기반으로 선형 회귀분석을 실시하였다. 그 중, 세포 수에 따라 가장 민감한 변화를 보이는 광학 필터의 조합을 골라 형광 처리를 하지 않은 자궁경부암 세포의 측면산란을 측정하였다.

그림. 6. DiD, Calcein AM으로 형광 처리된 자궁경부암 세포

Fig. 6. HeLa cells stained with Did and Calcein AM

2.3 광학 모니터링 실험

자궁경부암 세포의 광신호를 측정할 때, 유리 큐벳 내에 자석 교반기를 넣어 세포가 현탁액 내에서 잘 혼합되도록 하여 시스템적 오류 (Systematic error)가 발생하지 않도록 하였다. 형광 염료 DiD의 경우 Excitation/Emission 파장이 644nm/665nm이고 Calcein AM의 경우 488nm/517nm 이므로 DiD로 형광 처리한 세포는 620nm (Red)의 출력 파장을 갖는 LED를 사용하여 측정하였고, Calcein AM으로 형광 처리한 세포는 470nm (Blue)의 출력 파장을 갖는 LED를 사용하여 측정하였다⁽¹⁶⁾. 그림 7에서, Red LED를 사용하여 측정하는 경우 1차 필터 #19 Fire, #21 Golden Amber를 사용하였고 2차 필터 #27 Medium Red, #46 Magenta를 사용하였다. Blue LED를 사용하여 측정하는 경우에는 1차 필터 #369 Tahitian Blue, #377 Iris Purple을 사용하였고 2차 필터 #86 Pea Green, #389 Chroma Green을 사용하였다. 또한, 유세포 분석기와 달리 다이크로익 미러를 사용하지 않으므로 형광 산란만을 측정할 수 없다. 따라서 형광 처리를 한 세포로부터의 측면산란과 형광 처리를 하지 않은 세포로부터의 측면산란 측정값의 차이를 통해 형광 산란을 구하였다.

그림. 7. 필터 최적화를 위한 필터의 광학적 특성

Fig. 7. Optical characteristics of potential filter set

3. 실험 결과

자궁경부암 세포를 두 가지 형광 염료로 각각 처리하여 다양한 광학 필터를 사용하여 측면산란을 측정하고 세포 수에 따른 가장 민감한 변화를 보이는 필터의 조합을 살펴보았다. DiD로 형광 처리된 자궁경부암 세포의 경우 그림 8과 같이 나타내었고, Calcein AM의 경우 그림 9와 같이 나타내었다. 선형 회귀분석을 통해 회귀방정식을 추정하고 y 절편을 0으로 하여 직선과 점선으로 나타내었으며, 각 세포 수의 측정데이터의 평균값을 추정한 y 절편만큼 감소시켜 산점도 (scatter plot)로 나타내었다.

Red LED를 광원으로 선택한 후, DiD로 형광 처리하고 측정하였을 때 1차 필터 #19 Fire, 2차 필터 #46 Magenta를 사용한 경우가 기울기 (slope)가 53.045로 가장 높은 것을 표 1을 통해 알 수 있으며, 결정계수 ($R^{2}$)는 0.954로 측면산란 측정값은 세포 수를 95.4% 설명한다고 할 수 있다. 또한, 1차 필터 #21 Golden Amber, 2차 필터 #46 Magenta를 사용하여 측정한 경우와의 기울기 차이가 0.736의 근소한 차이를 보이므로, 이는 2차 필터에 의해 민감도의 차이가 발생하였음을 알 수 있다. Blue LED를 사용하고 Calcein AM으로 형광 처리하고 측정하였을 때 1차 필터 #369 Tahitian Blue, 2차 필터 #389 Chroma Green를 사용한 경우 기울기가 17.139로 가장 높은 것을 표 2를 통해 알 수 있으며 결정계수는 $0.933$ 이다.

그림. 8. DiD로 형광 처리된 자궁경부암 세포의 세포 수에 대한 측면산란

Fig. 8. SSC of HeLa cells stained with DiD for number of cells

그림. 9. Calcein AM으로 형광 처리된 자궁경부암 세포의 측면산란

Fig. 9. SSC of HeLa cells stained with Calcein AM about the number of cells

그림. 10. DiD와 Calcein AM으로 형광 처리된 자궁경부암 세포의 형광산란

Fig. 10. FL of HeLa cells stained with DiD and Calcein AM

형광 산란을 구하기 위해, 본 연구에서 제안한 광학 모니터링 시스템의 메인 모듈에 위치한 유리 큐벳에 Calcein AM과 DiD로 염색한 자궁경부암 세포 $10\times 10^{6}$cell / 2ml 를 주입한 후, 세포의 개수가 $1\times 10^{6}$cells / 2ml 가 될 때까지 세포의 수를 줄여가며 형광 산란 값을 측정하였다 (n=4). 측편 산란 실험을 통해 최적화된 필터를 사용하여 형광 처리를 하지 않은 자궁경부암 세포의 측면산란을 측정하고 형광 처리를 한 측정값과의 차이를 그림 10에 나타내었는데, Calcein AM으로 형광 처리된 실험군에서 형광 산란이 세포 수에 대해 더 밝게 측정되었음을 알 수 있다. 또한, 형광 염료의 종류에 따라 자궁경부암 세포 농도의 측정이 가능하였고, 선형 회귀분석을 통해 유추한 결과값과 실험값의 높은 선형성이 측정되었다. 따라서, 일정 수의 자궁경부암 세포를 본 광학 모니터링 시스템에 주입하였을 때, 출력 전압에 따라 세포의 농도가 측정/예측이 가능하다고 할 수 있다. 또한, 각각 다른 파장대의 1차 필터와 2차 필터를 사용하여 동시에 다른 형광물질로 염색된 자궁경부암 세포의 농도에 따른 출력 전압값을 통해 세포의 농도 판별이 가능하였다.

4. 결 론

본 논문에서는 저가의 LED와 광다이오드를 활용하여 세포의 광학적 특성을 측정할 수 있는 시스템을 설계하였다. 선행연구에서 제안한 형광 탐지 시스템에서 회로의 개선을 통해 광원인 LED의 광량을 높여 민감도를 증가시켰으며, 두 가지의 형광 염료와 다양한 필터를 사용하여 동시 측정이 가능한 시스템을 개발 후 그 성능을 평가하였다. 표본의 세포 수($1,\:2,\:3,\:...10\times 10^{6}$개)를 늘리고 표본의 수를 증가시켜서, 높은 신뢰도를 확인할 수 있었다. 형광 처리 여부에 따른 자궁경부암 세포의 측면산란으로부터 형광 산란을 분리시켜 형광을 측정할 수 있었으며, 이는 빛의 산란 정도와 형광의 정도를 통해 세포의 광학적 특성을 분석할 수 있음을 의미한다. 따라서, 간단한 형광 처리된 세포의 정량적 비교 및 분석만이 필요한 경우 상대적으로 저렴한 가격에 본 시스템을 구현할 수 있다는 장점이 있으며, 단일 세포뿐만 아니라 다양한 형광으로 염색된 이종 세포의 분석이 가능할 것으로 판단된다. 또한, 상용화되어있는 다양한 파장 대역의 LED와 광학 필터를 사용하여 목적에 맞는 시스템을 사용자의 편의에 맞게 설계가 가능할 것이다. 후속 연구로는 자궁경부암 세포뿐만 아니라, 폐암, 간암 등과 같이 치사율이 높은 질병 세포에 대한 광학적 특성을 분석하여, 세포의 선별성 확대 및 분석에 관한 추가연구를 진행할 예정이다.