1. 서 론

최근 들어, 인구 고령화 및 SNS 사용자의 증가에 따라 개인용 스킨케어 시스템에 대한 관심이 높아지고 있다. 또한, 시간을 절약하고 합리적인 비용으로 외모를 가꾸기 위해 개인의 선호 장소에서 능동적사용이 가능한 피부 관리 시스템 사용자가 증가하고 있다⁽¹⁾. 이에 따라 다양한 장소에서 전문시설수준의 피부 관리 등을 받을 수 있도록 저가의 스킨케어 시스템이 활발하게 개발되고 있다⁽²⁾. 스킨케어 시스템을 구성하는 요소 중 피부세포의 활성화를 촉진시키는 자극인가원으로 레이저나 LED (light-emitting diode) 등과 같은 광원이 사용되고 있으나, 비교적 고가이며, 사용이 불편한 레이저는 발생되는 고열에 기인한 유효조직의 열적 파괴를 야기할 수 있다는 한계점이 있어, 다양한 광 자극 중 비교적 저가이며 사용자의 목적에 따른 선택자유도가 높은 LED가 널리 사용되고 있다⁽³⁾. 이러한 이유로 LED를 활용하여 피부재생 효과를 정량적으로 평가하는 연구가 활발하게 진행되고 있는데, LED의 노출 광량 및 파장, 시간 등 광원의 특성에 따라 깊이가 상이한 피부 세포에 미치는 효과가 다양하다⁽⁴⁾. 예를 들어, LED의 405~420nm 파장 대역은 대부분 피부의 상피조직에 흡수되며, 조직 내 포피린을 자극하여 세포 내의 단일 산소를 보다 많이 생산하게 만들어 박테리아를 괴멸시켜 여드름과 같은 피부질환 치료에 유용하게 사용된다. 630~640nm 파장 대역은 피부의 진피조직까지 침투가 가능하고, 약 80%의 광 에너지가 2cm 내에서 흡수되는 특성을 보이며 조직 내 미토콘드리아를 자극하고 ATP 생성을 활성화시켜 세포 전도, 표면 순환 및 반염증 방출 등을 유도한다. 800~900nm 파장대역은 피부 깊이 침투하고 50% 정도가 8cm까지 침투하여, 조직 내 세포는 고온화 현상과 혈액순환 개선 등의 효과를 보이며 주로 통증 완화 효과를 유도한다⁽⁵⁾. 추가적으로, LED 광원 자극에 기인한 연구는 피부세포 이외의 다양한 세포를 타겟으로 하여 활발한 연구가 진행되고 있다^(6-9). 예를 들어, LED의 460nm 파장을 골세포에 인가하였을 때, 골세포의 증식과 세포 분화력에 긍정적인 자극을 유도한다는 사실을 알게 되었다⁽¹⁰⁾. 하지만, 광원을 이용한 세포 자극이 모두 세포 분화에 긍정적인 결과를 나타내지 않았으며, 특이 파장 대역은 노출 에너지, 노출 시간 등과 상관없이 세포 증식, 세포 독성, 상처 회복과 세포 재생 등에 직접적인 영향을 주지 않는 결과도 보였다⁽¹¹⁾. 이와 같이, 세포와 세포조직은 각각의 고유한 광 흡수 특성을 가지고 있으며 광선요법의 최대 효율을 위해서는 광이 목적하는 세포나 세포조직까지 침투할 수 있는 파장을 선정해야 한다. 비교적 장파장은 피부의 깊은 층에 있는 피지선의 활성화에 이용되고, 단파장은 광역학요법을 통해 표피에 있는 각질을 활성화해 피부의 표면 상태를 조절하는데 이용된다⁽⁵⁾. 피부세포 활성화를 위해 주로 LED를 활용한 단일자극 시스템은 지속적인 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 복합 파장 또는 비침습적 융합 자극을 응용한 피부 섬유아세포 또는 피부질환 등에 관련된 연구는 추가 응용연구가 필요하다. 예를 들어, 단일자극이 아닌 청색(415nm)과 적색(660nm)의 혼합 광원을 여드름 환자를 대상으로 사용하였을 때, 멜라닌의 수치가 감소하였고 단일파장 또는 과산화벤조일을 이용한 치료 효과보다 효과적이며 부작용이 감소하는 결과를 보였다^(12-13). 또한, 피부세포에 초음파 자극을 인가하였을 때, 콜라겐의 수축과 합성이 유도되고 국소적인 지방축적을 감소시킴으로써 피부 주름과 윤곽을 개선시킬 수 있는 긍정적인 효과를 보이는 연구도 진행되고 있다⁽¹⁴⁾. 초음파 자극은 출력 강도와 인가 시간이 표적 세포의 분화에 중요한 역할을 하게 되는데, 저강도 초음파 자극 (100 mW/cm², 300 mW/cm², 500 mW/cm²)을 치수줄기세포에 인가하였을 때 일정 세포 증식 효과를 보였으나, 그 이상의 초음파 강도를 인가하였을 때에는 유의미한 효과를 보일 수 없었다⁽¹⁵⁾. 추가적으로 초음파 자극을 20분 이하로 골세포에 인가하였을 때, 세포 증가분이 대조군에 비해 증가하는 경향을 보였으나, 그 이상에서는 초음파가 비주기적으로 동작하면서 탐촉자의 표면 온도가 상승하게 되어 세포가 열로 인해 괴사하게 된다는 사실을 확인하였다⁽¹⁶⁾. 초음파 자극은 세포 증식뿐만 아니라 세포독성에도 영향을 미치는데, 예를 들어 병풀의 추출물이 첨가된 배양액을 사용하여 섬유아세포를 배양한 실험군에 초음파를 인가했을 경우, 초음파를 인가하지 않은 대조군에 비해 세포 독성수치가 낮았고, 병풀 추출 시료가 피부 주름 생성에 중요한 역할을 하는 MMP-1 발현 저해 활성을 가지고 있어 주름 방지 효과가 증진될 수 있음을 확인했다⁽¹⁷⁾.

따라서 본 논문에서는, 상용화된 피부재생 마스크용 LED와 초음파를 이용하여 특정 위치의 섬유아세포에 인가가 가능한 멀티모달 자극 시스템을 개발하고, 광 자극과 초음파 자극의 단독인가와 동시인가 실험을 진행한 후, 현미경을 통해 획득된 영상을 이용하여 영상처리 및 통계분석을 통해 유의미한 차이를 보이고자 한다.

2. 실험 방법

2.2 광 자극 시스템

광 자극 시스템은 기존 LED 마스크에서 주로 사용되고 있는 LED (LG Innotek 3528, LG Innotek, Korea)를 사용하여 구성하였다. LED는 Red(630nm), Blue(415nm), Infrared (850nm) 파장의 발현이 가능하고, 실험의 목적에 따라 단일 또는 복합사용이 가능하다⁽¹⁴⁾. 칩의 재료는 InGaN/GAN (Blue), AlGaInP (Red), AlGaAs (Infrared)을 사용하였으며, 아두이노 우노 (Atmega328, Arduino)를 통해 정전류 모듈을 제어하였다. 광 스펙트럼 분석기로 LED 파장을 측정한 결과, 주파장 대역은 Blue는 405~425nm, Red는 620~640nm, Infrared는 840~860nm로 나타났다. LED를 이용한 단일/복합 자극 시스템은 그림 1과 같이 구성할 수 있다.

그림. 1. LED 단일/복합 자극 시스템

Fig. 1. LED single/multiple stimulation system

그림. 2. 3D 프린터를 이용한 광학 가이드 디자인

Fig. 2. Design of optical guide by 3D printer

LED에서 조사된 빛은 배양접시 하부에서 상부로 발광이 가능할 수 있도록 설계하고, 광학 자극이 세포가 배양되는 well의 중앙에 집중적으로 조사가 이루어질 수 있도록 그림 2와 같이 광학 가이드를 제작하였다.

광학 가이드는 3D CAD 프로그램 (SolidWorks, Dassault Systems, Solid Works Corporation, USA)로 모델링을 한 후, 3D 프린터 (Cubicon 3DP-310F, High Vision System, 성남, 대한민국)를 이용하여 제작하였다. 광학 가이드는 100% ABS (Acrylonitrile Butadiene Styrene copolymer) 재질로 제작하였으며, 각 파장에 맞는 LED를 선택적으로 광학 가이드에 고정시킨 후, 실험에 사용할 수 있도록 하였다.

LED의 구동 입력 전류가 10mA일 때, 동일한 조건하에 진행한 파장별 복사 강도는 표 1과 같이 나타났다.

표 1. 파장별 복사 강도

Table 1. Radiation intensity by wavelength

Color	Power (mW/sr)
	Min	Typ.	Max
Blue	2.0	-	4.0
Red	1.0	-	3.5
Infrared	0.2	-	2.2

2.4 멀티모달 자극 시스템

실험을 위해 섬유아세포를 배양한 후, 6 well plate에 각각 3×10⁴ cells/well로 분주하고 일주일 동안 배양하며 실험을 진행하였다. 세포증식 효과의 비교를 위해 다양한 파장의 LED 자극을 인가한 실험군 (n=17), 초음파와 LED 자극을 동시에 인가한 실험군 (n=17)과 자극이 없는 대조군 (n=20)으로 분류한 뒤 자극을 인가하였다. 멀티모달 자극 시스템은 그림 3과 같이 LED 광원, 광원을 제어하는 마이크로컨트롤러, LED 광원을 고정하는 광학 가이드, 세포배양 플라스크, 초음파 발생 프로브, 초음파신호 발생기 등으로 구성된다.

초음파와 LED의 동시 자극 실험을 진행하기 위한 멀티모달 자극 시스템의 실험구성은 그림 4와 같다. 실험군은 광학 자극 인가 그룹과 LED와 초음파 자극이 동시에 인가되는 멀티자극 인가 그룹으로 나누어 실험하였다. 실험군은 그림 5와 같이 6개의 well을 갖는 세포배양 플라스크에서 각각 실험에 사용되었고, 광학 자극 실험군은 섬유아세포가 배양되고 있는 well의 중앙에 광학 자극을 인가하는 총 3개의 그룹 A (Red), B (Infrared+Red+Blue), C (Infrared+Red)로 나누어 조사하였으며, 멀티자극인가 실험군은 각 well의 같은 위치에 광학 자극과 초음파신호 (US) 를 동시에 인가하는 3개의 그룹 D (Red+US), E (IR+R+B+US), F (IR+R+US)로 나누어 자극을 인가하였다. 단일자극과 멀티자극인가는 총 6일간에 걸쳐 매일 30분씩 인가하였다. 실험군의 배지는 자극이 없는 대조군과 동일하게 2일마다 한 번씩 교체해주어 같은 조건으로 실험하였다.

그림. 3. 멀티모달 자극 시스템의 개념도

Fig. 3. Conceptual diagram of multimodal stimulation system

그림. 4. LED와 초음파를 이용한 멀티모달 자극 시스템

Fig. 4. Experimental setup for multimodal stimulation system using LED and ultrasound probe

2.5 영상처리 및 정량분석

세포 이미지는 매일 자극인가 전후로 역상 광학 현미경 (Inverted fluorescent microscope, IX73, Olympus, Japan)을 이용하여 촬영하였다. 세포배양 플라스크의 커버에 미리 표시해둔 점을 기준으로 동일한 위치에서 획득함으로써 정량분석이 가능하도록 하였다. 광학 현미경으로 얻어진 세포 이미지들은 기존의 연구와 유사하게 MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) 프로그램이 제공하는 다양한 이미지 프로세싱 툴을 사용하여 분석하였다⁽¹⁹⁾. 간략하게 요약하자면, RGB의 컬러이미지를 단일 gray scale로 변환 후, adaptive threshold 등과 같은 알고리즘을 활용하여 배경과 타겟 세포와의 이진화 이미지로 변환하였다. 이진화 이미지 변환 후 노이즈 제거, 필터링, 주파수 변환 등과 같은 분석법을 이용하여 세포 타겟의 면적을 매일 측정하고, 정량분석 후 각 세포배양 플라스크의 면적과 비교하여 세포의 밀도 단위로 (%) 평균 증가분을 비교 분석하였다^(20-22).

그림. 5. 그룹 별 세포배양 플라스크 위치도

Fig. 5. Cell culture flask by group

그림. 6. 그룹별 세포 대표 영상

Fig. 6. Representative images of fibroblast cells per group

3. 실험 결과

자극이 없는 대조군 (control), LED 단일자극만을 인가한 실험군 (GroupA~C)과 초음파 자극을 함께 인가한 멀티모달 실험군 (GroupD~F)의 대표 이미지는 그림 6과 같다. 실험군과 대조군의 대표 이미지는 광학 현미경을 통해 자극이 인가된 후 획득되었으며, 날짜와 인가한 자극을 기준으로 비교하였다. 자극이 없는 대조군에 비해 단일자극 또는 멀티모달 자극을 인가한 실험군이 모두 세포 분화가 활발하게 진행되었음을 확인할 수 있으며 이는 Matlab을 활용하여 세포의 증식면적을 비교하여 정량화하였다.

그림. 7. 인가 자극 종류에 따른 세포 증가분 결과

Fig. 7. Experimental results of the cell density of fibroblast cell with various stimuli

그룹별로 얻어진 세포 활성도 평균 증가분 비교표는 표 2와 같다. Day1을 기준으로 증가분을 계산하였으며 비교표를 이용하여 작성한 그래프는 그림 7에 나타내었다. 그 결과, 자극이 주어지지 않은 대조군과 비교하였을 때 광 자극과 멀티모달 자극이 주어진 실험군 모두 세포 평균 증가분이 높았다. 그 중, 광 자극 실험에서는 R 파장대의 광 자극이 IR+R의 복합광 자극이 인가된 실험군보다 높은 증식률을 보였으나, 복합 파장대인 IR+R+B의 광 자극보다는 낮은 증식률을 보였다. 따라서 Blue 파장이 함께 인가된 GroupB (IR+R+B)가 가장 활발하게 증식하였음을 확인하였다. 반면, LED와 초음파 자극을 동시에(LED+US) 인가하는 멀티모달 자극의 경우, GroupD (R+US)의 자극이 다른 자극보다 높은 증식률을 보였다. 다른 자극에서는 GroupE (IR+R+B+US)와 GroupF (IR+R+US)를 비교하였을 때, Blue 파장이 함께 인가되었을 경우 세포 분화가 활발하게 이루어졌음을 알 수 있었다. 이는 비침습적 초음파 자극이 함께 인가된 멀티모달 자극은 단일 광 자극과는 서로 독립적인 결과를 나타냈으며, 광 자극 또한 파장대별로 다른 증식률을 유도함을 확인할 수 있었다.

4. 결 론

본 연구에서는 LED 마스크에 사용되는 다양한 파장대의 LED에서 발생한 광 자극이 섬유아세포의 증식 효과에 효과가 있는지 확인하였다. 또한, LED에서 발현된 광 자극뿐만 아니라 동시에 초음파 자극을 함께 한 멀티모달 자극의 세포 증식 효과 검증을 위해 피부 세포 활성도 제어시스템을 개발하였다. Red (630nm), Blue (415nm), Infrared (850nm) 파장을 단일 또는 복합적으로 광 자극 인가에 사용하였으며, 동시에 초음파 자극원으로는 10MHz 초음파 프로브와 광 자극을 함께 인가하여 세포 분화 정도의 평균 증가분을 비교함으로써 그 효과를 정량적으로 확인할 수 있었다. 광 자극과 멀티모달 자극을 인가한 실험군 모두 자극이 없는 대조군에 비하여 탁월한 피부세포 분화능력을 보임을 확인하였다. 그 중, 광 자극 실험에서는 Blue 파장이 함께 인가된 GroupB (IR+R+B)가 가장 활발하게 증식하였음을 확인하였다. LED와 초음파 자극을 동시에 인가하는 (LED+US) 멀티모달 자극의 경우, GroupD (R+US)의 자극이 다른 자극보다 높은 증식률을 보였다. 이는 상용화되어있는 피부재생 마스크가 사용하는 LED의 파장 대역 (Red 또는 Infrared)을 단일 인가하였을 때보다, Blue 파장이 추가되어 복합파장을 인가하였을 때보다 높은 증식을 보이며, 더 나은 피부재생 효과를 기대할 수 있을 것이다. 또한, 초음파 자극이 함께 인가된 멀티모달 자극은 단일 광 자극 (GroupA) 이 인가된 세포보다 높은 세포 증식률을 보였으나 복합파장이 인가된 경우보다는 낮은 세포 증식률을 보였다.

따라서 본 실험을 통해 세포 활성화를 증가시키기 위해서는 단일 광 자극보다 Blue 파장이 포함되어있는 복합 광 자극이, 그리고 초음파를 추가로 인가 할 경우에는 단일 Red 파장 대역보다 복합파장과 융합되었을 때보다 높은 세포증가분을 보임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 광학 파장대별 피부재생 및 각종 피부 치료 효과 등의 정량분석이 가능할 수 있을 것으로 기대되며, 향후 다양한 파장대와 주파수를 갖는 자극 시스템과 추가적 생화학기법을 활용하여 정량평가의 정확도 및 시스템 최적화를 위한 추가연구를 진행할 예정이다.