1. 서 론

티타늄과 티타늄 합금은 다른 금속재료보다 골(bone)과의 결합이 빠르고 생체적합성이 뛰어나 정형외과 분야에서의 인공관절(artificial joint)이나 골나사(bone screw)등으로 많이 사용되고 있으며, 특히 치과 분야에서는 매식 재료로서 상실된 치아 결손부 대체용 임플란트 재료로 현재 많이 이용되고 있다 ^[1]. 치과 임플란트 재료는 환자에게 안전해야 하며, 인체 내에서 장기간 기능을 유지할 수 있어야 한다 ^[2]. 특히 Ti-6Al-4V 합금은 우수한 기계적 성질과 생체적합성 때문에 치과용 임플란트 재료로 현재 가장 널리 사용되고 있다 ^[3]. 임플란트 식립 후 성공적인 골 유착(osseointegration)은 임플란트의 장기간 생존을 결정하는 중요한 요소이며, 임플란트와 주변 조직 간의 안정된 결합이 큰 역할을 한다 ^[4]. 이를 위해서는 임플란트의 표면 특성이 세포의 효율적인 부착과 주변 조직과의 상호 작용을 원활하게 지원해야 한다. 이는 임플란트로 사용되는 재료의 생체적합성 및 표면거칠기 등 다양한 요인에 의해 결정된다 ^[5].

생체 조직과 임플란트 표면 사이의 생물학적 반응을 향상하고 식립 이후, 골(bone)과 임플란트 경계면에서 새로운 골조직의 형성을 최대화하는 것을 목표로 티타늄 임플란트의 표면처리 연구는 다양하게 진행되었다 ^[6]. 최근 골 유착을 개선하고 초기 치유 시간을 단축하기 위해 임플란트 표면에 나노 구조의 칼슙(Ca)이 함유된 표면을 가진 티타늄 임플란트(XPEED®)가 소개되었다 ^[7]. 이 표면 처리는 티타늄 합금 표면에 산성 잔류물의 위험을 제거하고 칼슘 이온을 생체 조직에 공급하여 기존의 티타늄 임플란트 표면 처리보다 생체 활성도가 높다고 보고되고 있다 ^[7]. 또한 XPEED는 동물 실험에서 골과 임플란트 사이의 결합을 크게 개선하는 것으로 보고되었다 ^[8].

티타늄 임플란트 표면거칠기를 개선하기 위해 상업적으로 가장 많이 사용되는 방법으로는 거친 산화알루미늄(Al2O3)연마 입자(0.2 mm ~ 0.5 mm)를 티타늄 합금 표면에 분사한 다음, 강산을 사용하여 에칭을 수행하는 SLA(sandblasted, large-grit & acid-etched) 공법이 대표적이다 ^[9]. 이러한 SLA공법은 티타늄 표면의 미세 거칠기와 친수성을 높이는 기술이다. 이 공법에서 황산(H2SO4)과 염산(HCl)으로 구성된 에칭 용액에 임플란트를 침적시키면 불규칙성 형태의 마이크론 및 미크론 크기의 기공(pore)이 고르게 분포되어 있는 표면 거칠기를 형성한다. 이러한 개선된 표면은 골유착을 통한 골개조(bone remodeling) 단계에서 넓은 표면적과 높은 표면 에너지를 유지하며, 단백질 흡착 및 세포 부착 뿐 만 아니라, 주변 골조직과의 더 강한 기계적 결합을 유도한다 ^[9]. 그러나 SLA 표면처리 방법은 시간이 지남에 따라 다양한 불순물이 임플란트 표면에 침착되어 표면 에너지가 감소하고 결국 초기 임플란트 골유착의 효율이 저하되는 단점이 있다 ^[10]. 특히 탄화수소(C-H)계 불순물은 일반적으로 단백질 흡착과 조골세포의 부착에 부정적인 영향을 준다고 알려져 있다 ^[11,12]. 이로 인해 연구자들은 우수한 생체활성(bioactivity) 임플란트 표면을 구현하기 위해 많은 노력을 기울여 왔다.

표면 에너지를 높이고 탄화수소 불순물을 줄이려는 방안으로 플라즈마 처리 기술이 제안되었다 ^[13]. 대기압이나 적당한 진공 상태에서 플라즈마가 방출될 때, 불완전한 이온화 과정이 고에너지 라디칼(radical)를 생성한다. 이러한 고에너지 라디칼은 재료 표면의 화학적 변형(chemical modification)에 매우 유용하다 ^[14]. 이러한 화학적 변형은 티타늄 재질의 임플란트 표면에 젖음성을 증가시켜 세포 및 단백질 부착을 증대시키는 역할을 하게 된다 ^[14]. 또한 선행 연구에서 치과용 임플란트에 플라즈마 처리의 효과는 양(sheep)을 이용한 동물실험 결과에서 골 유착을 유의성 있게 증가시킨다고 보고하였다 ^[15]. 특히 최근 일부 연구에서는 플라즈마 처리가 UV 기능화(UV-functionalization)보다 친수성 표면을 생성하고 세포 접착 및 증식에 더 나은 환경을 제공하는 것으로 보고되고 있다 ^[16]. 골조직과 임플란트와의 계면에서 빠른 골 유착을 유도하기 위해서는 임플란트 표면에 플라즈마 처리를 이용하여 생체 활성을 촉진하는 공법이 필요하다. 그러나 임플란트 표면처리는 기능적인 측면에서 매우 중요하지만, 임플란트 표면처리 후 생체활성화 개선을 위한 추가 플라즈마 처리에 관한 연구는 여전히 부족한 실정이다.

본 연구에서는 XPEED 처리된 티타늄 표면에 균일한 플라즈마 처리를 위해 진공 플라즈마 장치를 사용하였다. 임플란트 표면 생체활성화를 위한 추가적인 플라즈마 처리가 조골세포 부착 정도에 미치는 영향을 평가하기 위해 XPEED 표면과 SLA 표면처리된 티타늄 디스크 시료를 사용하여 상호 비교 평가하였다.

2. 본 론

본 연구에서 사용된 시편은 직경 10 mm, 두께 2 mm 크기의 티타늄 디스크로 XPEED 표면처리된 그룹(XPEEDActive, AnyOne, MEGAGEN, Korea)과 SLA 표면처리된 그룹(SLActive, AnyOne, MEGAGEN, Korea)으로 나누어 제작되었다 ^[17]. XPEEDActive는 세포 부착 실험을 진행하기 전에 플라즈마 장비(Plasma X, MEGAGEN, Korea)를 사용하여 추가적인 표면 처리를 진행하였다. SLActive는 포장 수용액(NaCl solution)에 침적시켜 합금 표면 생체활성화 처리를 수행하였다(Fig 1).

미세 구조 관찰을 위해 두 그룹의 디스크 모양 시편을 30 kV의 가속 전압과 30 mA의 빔 전류로, Cu Kα 방사선(λ = 0.5418 nm)을 사용하는 X선 회절법(XRD, MAXima_X XRD-7000, Shimadzu, Kyoto, Japan)을 이용하여 상 분석을 수행하였다. 스캔 범위는 5˚~70˚까지이며, JCPDS(Joint Committee of Powder Diffraction Standard) 데이터베이스의 알려진 상의 스펙트럼을 참조하여 각 상을 식별하였다 ^[8]. 또한 두 그룹의 표면 형상 및 불순물 오염을 확인하기 위해 주사전자현미경(SEM, Scanning Electron Microscopy, S-4800, Hitachi, Japan)과 에너지 분산 X선 분광법 (EDS, Thermo Fisher Scientific, Phenom XL)을 사용하였다. 접촉각 측정을 위해 접촉각 측정기 (Phoenix300 Touch, SEO Co., Ltd., Korea)를 사용하여 측정하였다. 접촉각 시험 수행 시 5 ㎕를 시료 표면 위에 한 방울 떨어뜨린 후, 왼쪽 및 오른쪽 각도를 측정하였다. 접촉각 측정 용액은 증류수를 사용하였다. 접촉각 이미지 분석 프로그램 소프트웨어 (Surfaceware 9; SEO Co., Ltd., Korea)를 이용하여 분석하였다.

세포독성 실험은 24시간 전, 24 well plate에 L929 섬유아세포 세포주 현탁액(5x104cells)을 넣고 37℃, 5% CO₂ Incubator에서 24시간 동안 배양하였다. Plate의 바닥 면적이 80% 정도 세포가 증식하면 37℃에서 용출시킨 검액 및 대조액을 넣고 37℃, 5% CO₂ Incubator에서 24시간 동안 배양하였다 ^[18].

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약을 세포에 처리한 후 흡광도를 측정하였다. 검액 대비 세포 생존율이 70% 이상일 때 세포독성이 없는 적합한 상태로 판정하였다 ^[19]. 시험 조작은 엄밀한 무균 환경하에 무균작업대(clean bench)내에서 실시하였으며 세포 독성 실험에 사용되는 모든 기자재는 멸균하여 사용하였다. 세포 부착 실험은 L929 섬유아세포 세포주, 7x10⁴cells을 사용하였고, 37℃, 5% CO₂ Incubator내에서 24시간 동안 시료의 표면 위에서 배양(seeding)하였다. 배양이 완료된 후에는 세포를 고정시킨 후 10시간 이상 충분히 건조하였으며, 고정액을 세척 후 세포가 부착된 표면을 SEM을 통해 관찰하였다. 연구 결과의 유의성 검증은 SPSS 통계 프로그램(SPSS 20.0 for windows, SPSS Inc., Illinois, USA)에서 t-검정(t-test)을 실시하였다(α=0.05).

Fig. 1. Schematic illustration of the XPEEDActive and SLActive process to titanium.

3. 결과 및 고찰

Fig 2는 XPEEDActive와 SLActive 그룹의 XRD 결과를 보여준다. XPEEDActive 그룹에서만 CaTiO3(JCPDS #22-0153) 피크가 관찰되었다.

Fig. 2. X-ray diffraction patterns of XPEEDActive(a) and SLActive(b).

Fig 3는 XPEEDActive 및 SLActive 그룹의 표면 형상을 보여준다. XPEEDActive 표면에서는 샌드 블라스팅(Sandblasting) 공정에서 medium-grit의 alumina powder를 사용하기 때문에 SLActive 표면과 비교했을 때, XPEEDActive가 비교적 표면의 macro 구조의 pore가 일정하고 균일한 것을 볼 수 있다. XPEED Active는 Ca 코팅 처리 단계에서 열수처리(Hydrothermal Treatment) 과정을 진행함으로써 micro-macro 조합의 pore 구조를 관찰할 수 있다. 반면에 SLActive는 강산처리로 인해 불규칙한 와동 및 날카로운 모서리(sharp edge)가 표면에 많이 형성된 것을 볼 수 있다. 이러한 표면은 샌드 블라스팅 공정에서 크기가 큰 large-grit의 alumina powder로 인해 형성된 와동을 강산처리에 의해 침식 효과가 가속화된 것으로 사료된다.

Fig. 3. SEM images of the XPEEDActive(a) and SLActive(b).

Fig 4은 XPEEDActive 및 SLActive의 EDS 분석 결과를 보여준다. 두 그룹에서 Ti와 O원소의 함량 차이는 유사한 것으로 나타났다. 하지만 XPEEDActive는 SLActive보다 탄소 함량이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있다. 두 그룹의 탄소 함량 차이는 약 17%로 나타났다.

Fig. 4. EDS images of the XPEEDActive(a) and SLActive(b).

Fig 5는 XPEEDActive 및 SLActive의 접촉각 측정 결과를 보여준다. XPEEDActive는 약 6° 정도로 나타났으며, SLActive는 30° 정도의 접촉각을 보였다. 본 결과에서 XPEEDActive 표면이 매우 높은 친수성을 나타내는 것으로 확인되었다.

Fig. 5. Contact angle of XPEEDActive(a) and SLActive(b).

Fig 6는 MTT assay 결과를 나타낸다. 용출물 처리된 L929 세포의 세포생존율은 대조군의 세포생존율 100%를 기준으로 XPEEDActive가 99.77±4.16 %, SLActive는 85.06±2.52 %로 나타나 검액 대비 세포 생존율이 70% 이상의 기준에 적합하였다. 또한 XPEEDActive 및 SLActive 실험군에서 세포독성이 없음을 확인하였다. 하지만 SLActive는 XPEEDActive보다 다소 세포 생존율 효율이 낮은 것으로 나타났다 (p<0.05).

Fig. 6. MTT cell viability assay of XPEEDActive(a) and SLActive(b) for L929 fibroblasts.

Fig 7는 세포부착 실험 후 각 표면에서 세포 부착 정도를 확인하고자 SEM을 이용하여 표면을 관찰하였다. 그 결과, XPEED Active는 비교적 pore의 크기가 균일한 표면을 보유하고 있으며 그 위에는 약 26개의 세포가 부착되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 현상은 시료로 사용된 임플란트 전체 표면적에서 나타났으며, XPEEDActive 표면과 세포 간의 상호작용이 강하게 일어나면서 세포가 잘 부착될 수 있는 것으로 사료된다. 반면에 SLActive는 굴곡이 있고, 높낮이가 심한 sharp edge 표면 위에 약 14개의 세포가 부착되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 표면의 특성으로 인한 세포의 성장성을 비교하고자 단일 세포들이 성장한 형상을 추가적으로 고배율에서 관찰하였다. XPEEDActive 단일 세포에서 뻗은 Filopodia의 개수는 약 14개 였으며, 그 중에서 가장 긴 길이는 11.3 ㎛ 정도로 나타났다. 그리고 주변의 세포들과 연결되고 확장되어 있는 것으로 나타났다. 대조적으로 SLActive에서는 세포의 몸체에서 뻗은 Filopodia의 개수는 약 11개 수준으로 나타났다. 또한, 세포의 몸체에서 뻗어 나온 가장 긴 돌출부의 길이는 5.2 ㎛ 수준으로 확인되었다. XPEEDActive와 SLActive에서 모두 세포는 잘 성장한 것으로 관찰되었다. 이는 실험에 사용한 Fibroblast cell로 친수성이 높은 표면에서 잘 자란다고 알려져 있고, 수용액 포장과 플라즈마 처리로 인해 두 그룹의 표면 활성화도가 높아졌기 때문이라고 사료된다. 하지만 세포의 형상에서 다소 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다. 선행 연구에 따르면 세포는 생체재료 표면의 거칠기가 증가하면 거친 표면과의 상호작용을 통해 부착력과 성장력이 증대될 수 있다고 알려져 있다 ^[18-21]. 또한, XPEEDActive의 표면에 결합되어 있는 Ca 이온은 단백질 흡착, 세포부착, 세포 증식 등을 증진시킬 수 있는 역할을 하기 때문에 XPEEDActive 표면이 SLActive 표면 보다 세포가 성장할 수 있는 유리한 환경을 제공하고 있는 것으로 사료된다 ^[22].

Fig. 7. SEM images of L929 cells adhered on XPEEDActive and SLActive

4. 결 론

본 연구에서는 XPEED 처리된 티타늄 표면에 균일한 플라즈마 처리를 위해 진공 플라즈마 장치를 사용하였다. 임플란트 표면 생체활성화를 위한 추가적인 플라즈마 처리가 조골세포 부착 정도에 미치는 영향을 평가하기 위해 XPEED 표면과 SLA 표면처리된 티타늄을 사용하였다. 연구의 범위는 XPEEDActive와 SLActive의 표면에 대한 미세구조 및 표면 특성, 세포 독성, 세포 부착, 그리고 접촉각 측정 평가를 수행하여 비교 하였다. 세포 독성 평가에서 XPEEDActive와 SLActive는 검액 대비 세포 생존율이 기준 규격에 적합한 것으로 나타났다. 특히 XPEED Active에서 세포 생장률이 다소 높은 것으로 나타났다. 이러한 현상은 XPEEDActive가 플라즈마 처리로 인해 표면에 붙어있는 불순물이 제거되면서 SLActive보다 세포가 성장하기 좋은 환경을 갖고 있는 것으로 판단된다. 또한, 세포 부착 실험에서도 유사한 결과를 확인할 수 있었다. XPEEDActive에서 SLActive보다 세포가 더욱 잘 붙어있으며, filopodia가 길게 성장한 것을 알 수 있다. 이는 SLActive에는 없지만, XPEEDActive가 갖고 있는 나노 구조와 Ca 이온으로 인해 세포 부착력이 증대될 수 있는 환경을 조성하고, 추가적인 플라즈마 처리가 더해졌기 때문에 강력한 표면 우수성이 나타난 것으로 추측할 수 있었다. 또한 접촉각 측정 결과에서 XPEEDActive가 SLActive보다 우수한 표면 친수성을 가지는 것으로 확인되었다. 표면 젖음성은 단백질의 흡착, 세포 접착 및 퍼짐에 매우 중요한 역할을 한다 ^[23].

결론적으로, XPEEDActive는 SLActive와 비교했을 때 세포가 성장하기에 유리한 표면 특성과 젖음성이 개선됨으로써 기존의 SLActive보다 개선된 표면 처리라는 것이 입증되었다. 따라서 이러한 개선된 임플란트의 티타늄 표면은 확실한 골유착의 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 표면 구조의 특성상 XPEED가 보유한 칼슘 이온과 나노 구조로 인해 세포 부착이 좀 더 강하게 이루어지며 안정적인 성능을 나타내는 것으로 볼 수 있다. XPEED 표면에 부가적으로 플라즈마 처리를 진행한 XPEEDActive 표면의 임플란트는 특히 골질이 좋지 않은 환자들에게 더욱 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 판단된다. 본 연구의 제한점으로는 XPEEDActive 그룹에서 플라즈마 처리 전과 후에 탄소 노출 정도를 정량적으로 평가하지 못하였다. 또한 동물 실험을 통해 초기 골유착에 대한 정보가 부족하였다. 따라서, 향후 다양한 임상 케이스 연구를 통해 XPEEDActive에 대한 추가적 임상 유효성 검증 단계를 수행해야 할 것으로 사료된다.